1.蛋白质的分离和提取个是什么步骤

一、基本原理

分离纯化蛋白质，首先要从原材料中提取目的蛋白，然后通过粗分离的方法除去大量杂质，最后进行精细分离，得到目的蛋白。本实验以新型基因重组人TNF为例阐明重组蛋白TNF的提取及初步分离。

TNF的提取是将发酵菌体裂解，在一定的条件和溶液中，使被提取的TNF充分释放出来，经离心收集混合液中提取的TNF成份的过程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的杂蛋白，由于蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质分子表面的水分子数目，即蛋白质表面亲水基团与水分子形成水化膜的程度和带电荷的情况，当中性盐如硫酸铵等加入蛋白质溶液时，由于中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，使蛋白质分子周围的水化膜减弱或消失，蛋白质溶解度降低，同时由于中性盐的加入，蛋白质溶液的离子强度发生了改变，蛋白质表面电荷被大量中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间互相聚集而发生沉淀。不同的蛋白质由于其带电性，亲水性等性质的不同，会在不同浓度的盐中形成沉淀。依此原理可对混合蛋白质进行粗分离。该实验中利用硫酸铵盐析除去大部分杂蛋白从而使TNF得到初步纯化。

二、试剂配制

1、STE(25%蔗糖 10mmol/L Tris-HCl pH 8.5 1mmol/L EDTA)。

方法：取蔗糖250g,1mol/LTris.HCl10ml,0.5mol/L EDTA2ml，加水至1000ml115℃，20min高压灭菌。

2、1mol/L MgCl2。

方法：取MgCl2 203.30g，加水至1000ml。

3、Tris-HCl pH8.5。

方法：取Tris 121.14g，用HCL调pH至8.5，加水至1000ml(12mol/L HCl 约30ml)。

4、0.5mol/L EDTA pH8.5。

方法：取乙二氨四乙酸二钠186.12g,NaOH20g，加水至1000ml，在121℃下，进行20min高压灭菌。

三、

操作步骤

1、称取菌体重量，按5~10ml/g菌体加入STE溶液，搅拌至菌体完全悬浮。

2、按0.5~1mg/g菌体加入用STE溶液新鲜配制的溶菌酶溶液，用玻璃棒用力搅匀后于4℃环境中放置20min。此时菌液呈粘稠状。

3、按10mg/g菌体加入用STE溶液新鲜配制的脱氧胆酸钠（DOC）溶液，用力搅匀。

4、加入5~10ml 1mol/L MgCl2溶液，搅匀后加入约40μl Dnase I(25mg/ml)充分搅拌至菌液变稀。

5、15000rpm,4℃离心30min。

6、取离心上清，精确量取其体积，测定蛋白质浓度，倒入置于冰浴的烧杯中，边搅拌边缓慢加入固体硫酸铵使其达到50%饱和度。待固体硫酸铵安全溶解后，静置于0℃环境中30min。

7、离心，15000rpm,4℃，30min。取离心上清，量其体积，测定蛋白浓度。

8、将离心上清装入透析袋，4℃搅拌在pH8.5 20mmol/L Tris-HCl ,1mmol/L EDTA溶液中透析。

四、注意事项

1、加入硫酸铵不论是固体硫酸铵，还是加入饱和硫酸铵溶液，加入时应边加入边搅拌。

2、加入硫酸铵要慢，因为太快会引起蛋白质发生共沉淀，加入固体硫酸铵时事先要将硫酸铵研磨成粉末，加入饱和硫酸铵溶液时要一滴一滴地加入。

3、搅拌要慢，搅拌剧烈，蛋白质溶液容易起泡沫，由于表面张力效应会引起蛋白质变性。

2.如何提取和分离蛋白质

1.样品处理 一般会采用猪、牛、羊或其他脊椎动 物的血液来分离血红蛋白。

（1） 红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目 的是为了去除杂蛋白，以利于后续步骤 的分离纯化。首先采集血样，用离心机 低速、短时间离心，然后再用胶头吸管吸 取上层黄色血浆。

将下层暗红色的红细 胞液体倒入烧杯中，加入5倍体积质量 分数为0.9%的NaCl溶液，缓慢搅拌10 分钟，再次低速、短时间离心，如此重复 洗涤三次，直至上清液没有黄色。 血红蛋白的释放：将洗涤好的红 细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液体 积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅 拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破 裂）。

在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破 裂释放出血红蛋白。

3.生物化学,几种蛋白质的分离及分离原理

蛋白质的分离纯化方法有：

1、沉淀，

2、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。

3、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。

4、层析：

a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定PH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。

b.分子筛，又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能同时入孔内而径直流出。

5、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。

所以要想分离，必须得先把这几种蛋白质的性质搞定，需要从中国期刊网上查找相关文献，然后确定下来后再仔细组合上面的方法进行分离。

4.求蛋白分离纯化步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性.所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎.常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎.常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等.2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎.3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破.这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法.4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎.5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等.（二）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来.抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定.如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离.在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性.（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来.比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离.常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离.2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出.被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性.3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低.能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质.此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出.由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度.（四）样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品.常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等.有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品.。