很宽极有可能是扩增出两个或多个大小相近的片段，这种片段测序结果往往都是乱封，是多个序列测序结果叠加在一起的。解决办法，更换特异引物，或者胶浓度加大，比如2%的。电泳时间久一些，比如40分钟，就有可能将其分开，然后再切胶回收。

如何写一篇高质量的ROC分析文章

一、 ROC分析的基础。

检验医学的论文大题可以分为两类，一类是方法学论文，只要是质量控制，方法学评价，对比等，另一类就是实验室指标的应用，使用指标诊断疾病，观察指标与疾病预后和病理分期的关系等。ROC分析的文章就属于后者，其目的主要是评价某指标对某种疾病的诊断意义。如“AFP在肝癌诊断中的作用”，“CEA，NSE联合诊断肺癌”等。
众所周知，用单一实验室指标去诊断疾病，单独提高敏感性必然会降低特异性，反之亦然；换句话说，减少误诊必然增加漏诊。比如，某医师欲采用AFP诊断肝癌，该医师制定的诊断标准是AFP大于10mmol/L，显然按照此标准诊断肝癌，具有很高的敏感性，是不会漏诊肝癌的的，因为几乎所有的肝癌患者AFP都大于10 mmol/L。但是另一方面，依据此标准却容易造成误诊，因为AFP大于10 mmol/L的病人中，除了肝癌还有肝炎和肝硬化等肝脏疾病。该医师意识到这个问题后，将肝癌诊断标准从10 mmol/L提高到1000 mmol/L，并以此作为诊断肝癌的标准，显然，以此为标准，自然是不会误诊病人，因为AFP大于1000 mmol/L几乎就可以肯定是肝癌了。但是另一方面，却增加了漏诊，因为不是所有的肝癌患者AFP都大于1000 mmol/L的。由此可见，漏诊和误诊之间是相互矛盾的，减少误诊必然以增加漏诊为代价，减少漏诊又必然以增加误诊为代价，敏感性与特异性始终是鱼与熊掌不可兼得的矛盾。
那么该如何协调灵敏度和特异性呢？最好的方法就是做ROC分析（注意：ROC只是针对计量指标）。将病例组和与之难以鉴别诊断的疾病放在一起，采用需要研究的指标去诊断疾病，以1-特异度为横坐标，敏感性为纵坐标。观察指标变化时，敏感性与特异性的关系，绘制ROC曲线（具体程序都有SPSS完成）。然后根据曲线的结果对指标进行判断。
ROC 有什么用途呢？大体上说，主要有以下几种用途：1，判断单一指标的诊断效力，曲线下面积越大，指标的诊断效力越大；2，比较不同指标的诊断效力。
不懂的再看看相关书籍。

二， 如何设计一个高质量的ROC分析
2．1．样本例数的估计
大部分研究，在开展之前，一定要进行样本数的估计，样本量太少，统计效率低下，容易犯2类错误。样本量太高，不仅造成经济上的浪费，还增加了很多不可控制的因素，降低了实验质量。国内部分医务人员单纯认为样本量越大，研究结果越可靠，这是片面的。实际上，个人认为，一般研究，把样本量控制在最小估计样本量的上限再加20％就可以了（主要是在前瞻性的研究中防止脱落）。
样本量的估计由于园子里无法打公式，我就不写了，具体可以参考相关书籍。
2．2 对照组和实验组的设置
一个实验室指标，要不仅要强调其敏感性，还要强调其特异性，对照组的设置主要是为了体现指标的特异性，即鉴别诊断的能力。基于此，对照组的设置应该是和疾病组症状相似，如果不采用实验室诊断指标是很难进行鉴别的疾病。比如肝硬化和肝癌。国内部分文章，在设立对照组时加入了健康人群组，这是不科学的。因为健康人群和有疾病的人群通过症状体征基本就能鉴别，何需实验室指标。当然，如果一个指标是很新颖的指标，或者无症状疾病的诊断（这类疾病很少），在首次或者最初的研究中可以加入健康对照组，以观察疾病组和健康对照组之间是否具有差别，这是可以理解的，但是对于研究有明显症状，可以轻而易举和健康人区分的疾病，是不需要设立健康对照组的。实验组和对照组应该充分体现在均质上面，就是不采用实验室指标，光凭症状病史很难进行鉴别诊断的一类人群。最好的方法就是采用统一的纳入标准。比如，欲使用AFP诊断肝癌，较好的纳入标准就是将医院所有年龄大于40周岁，有黄疸或者其它肝病症状，怀疑为肝癌患者的首诊人群，至于纳入研究的人群是肝癌还是其它良性肝病，先不用管，使用指标鉴别诊断就是。需要说明的是，具体的标准根据专业知识而定，上面列出的标准仅仅供参考。一个ROC研究质量的高低，在很大程度上取决于纳入标准的科学性，这也是对研究者能力的考验。
国内部分杂志甚至部分国外杂志，在纳入研究对象的时候，仅仅说实验组有多少名病例组成，对照组有**病**例，**病**例。这实际上是不科学的，或者不值得提倡的。比如同样对RF诊断RA进行研究，某研究人员只是简单交待对照组由强直性脊柱炎20例，系统性红斑狼疮30例组成DD这很难反映这些疾病与肝癌是否需要鉴别，因为有的强直性脊柱炎和红斑狼疮因为症状比较典型，是不需要和RA进行鉴别的。同时还牵涉到另外一个问题，就是没有对疾病进行病理分期。
很多指标，与疾病的病理分期有关。比如肿瘤标志物。也有的与疾病的病程密切相关，比如心肌损伤标志物。在对这一类指标进行研究时，一定要考虑疾病的分层。比如研究CK对AMI的诊断作用，一定要在纳入标准中限制就诊时间，比如规定本研究只纳入急性胸痛后2小时内就诊的人群，且都在一个时间段内（比如胸痛后3－4小时）进行检测，当然，限制的时间越窄，研究质量越高，但是病例越少，研究难度越大，所以自己需根据研究能力，专业知识等决定纳入标准。对于与病理分期有关的疾病，如果有足够的病例进行分层，可以分层研究，如果没有，应该交待病例构成，病例构成最好能接近实际情况（依据专业知识掌握），有的还可以根据专业进行其它基线特征的比较，比如：在AFP诊断肝癌的研究中，可以采用卡方检验对病例组和对照组的肝功能（分级）进行比较。实际上，在进行ROC分析前，最好比较两组的其它指标是否均衡，若不均衡，那说明纳入标准还不是很严谨，或者说明该指标也可以作为诊断指标，可将其也进行ROC分析。
国内多数论文不交待病例构成，没有两组其它特征的比较，甚至连基本的年龄，性别比较都没有。让读者无法判断两组病例是否均质，该研究是否有意义。
需要说明的时，研究纳入标准越严格，病例分层越细，研究质量越高，但是研究难度越大。具体需要达到什么样的研究目的，有无必要进行分层和严格限制等，研究者根据实际情况而定。
2.3 实验组一定要有金标准
所谓金标准，就是确诊一个疾病的方法或者方案。对于实验组病例的纳入，一定要使用金标准确诊。换句话说，纳入实验组的病例就应该是纳入一个算一个。相反的，有时病例组要求不是太严格。
常用的确诊方法，比如：RA，应采用1987年美国风湿病学会的诊断标准确诊，肿瘤应根据病例确诊，胆结石应该根据术中所见确诊。具体的金标准可以参考各个专业的相关知识。国内多数ROC分析文章对金标准交待不明确，让读者无法判断研究的质量。这是不严谨的表现。
2.4 ROC相关参数的解释
由ROC曲线产生的参数较多，cut-off值，敏感性，特异性，曲线下面积（AUC），阳性预测值，阴性预测值，阳性似然比，阴性似然比，约登指数等。在进行专业解释时，一般无需全部列出，但是cut-off值，敏感性，特异性，曲线下面积（AUC）是必须交待的。
国内部分论文在讨论相关指标时，常犯的错误有：各个指标没有可信区间，以样本代替总体，简单地认为AUC越大，诊断效力越高。有的甚至认为约登指数才是判断诊断效力的关键，实际上约登指数只是对一个点而言，并不能反映指标的变化后，敏感性与特异性的变化，同时约登指数也只能初略地确定cut off。
在同一个试验中比较两种指标时，要得出单一指标的诊断效力高，一定要使用AUC比较，但是这个比较并不是简单数值上的比较，而应该使用相关的统计方法。其方法比较繁琐，建议找专业人士。关于敏感性和特异性的比较，也因该有相关的比较检验方法。因为我们研究的是样本，存在抽样误差，不能用样本代替总体进行讨论。
同时AUC的取值是介于0.5和1之间的，不可能低于0.5，国内部分文章，在处理某些降低才具有意义的指标时，受定式思维的影响，居然出现了AUC小于0.5。纯属无稽之谈。
讲个例子，某人喜欢预测别人生男孩还是生女孩，如果预测的情况90％都是正确的，那可以说某人预测得比较准，如果某人预测的情况90％都是错误的，难道这个预测就没有用了吗？聪明点的人就会反过来想，要是预测生男孩，就可以理解为要生女孩，且不是准确性又是90％。
2．5 多个指标的联合诊断
指标之间的联合诊断可分为系列诊断实验（串联）和平行诊断实验（并联），具体用什么联合方法，依据专业而定。有的疾病，如果需要早期诊断，早诊断对预后影响巨大的，采用并联，如急性心肌梗死。有的疾病强调特异性的，比如SLE，可以采用串联，提高特异性。说简单点：串联就是所有指标阳性才算阳性，并联就是只要有一个指标阳性就算阳性。
当然，几乎所有的疾病，都是越早诊断越好，诊断越准确越好，有时很难划分清楚二者界限，除了少数疾病。因此，从谨慎的角度出发，研究者可以同时列出串联模式和并联模式，供读者自己选择。
国内部分论文，在使用指标联合诊断时，要不不交待联合方式，要不就是串并联混乱使用，让读者无从理解。
实际上，根据常识可以推断，两个指标不管是串联还是并联，提高敏感性就会降低特异性。串联时多个指标共同阳性才算诊断成立，因此提高了特异性，同时降低了敏感性，并联时只要有一个指标阳性，诊断就成立，提高了敏感性，降低了特异性。多个指标联合诊断是不可能出现敏感性和特异性同时升高的情况的。也就是说联合诊断是，如果敏感性较任何一个指标高（至少相等），那说明作者用的是并联，特异性就应该较任何一个参与联合的单一指标低；反之，如果联合诊断后特异性较任何一个指标高（至少相等），那说明作者用的是串联，敏感性就应该较任何一个参与联合的单一指标低；国内部分论文，在联合诊断后，居然出现指标敏感性和特异性同步升高的情况，是不符合逻辑的，说轻点就是计算错误，说重点就是DDD
同时，指标之间的联合是一个点与点的联合，是两个cut－off的联合，不存在AUC这一个指标，AUC是在指标变化的时候产生的曲线面积，指标已经固定某值，何来AUC。国内部分论文在联合时又冒出个联合AUC，也属无稽之谈。
有的文章甚至抛开ROC曲线，使用参考范围上限作为诊断界值，实属不理解ROC分析所致。
2．6 站在临床的角度，客观评价ROC分析
从理论上讲，多数情况下，多个指标的联合有助于提高疾病诊断的准确性，但是我们应该意识到，多个指标联合，会增加病人的经济负担，在诊断效力相似的情况下，肯定优先选择少量廉价的指标诊断。同时，一个指标，要成功运用于临床，必然要综合其各方面优缺点的，比如，是否易于检测，是否稳定，是否廉价，是否及时等。国内多指标联合诊断的ROC分析论文，多忽视临床需要，盲目推荐多个指标的联合诊断，脱离临床实际，削弱了文章的使用推广价值。因此在下结论推荐诊断指标，或者指标组合时，因充分考虑以上因素，慎重推荐。
2．7 理智对待ROC分析
ROC分析虽然综合了敏感性和特异性，客观评价了指标的诊断效力，但是也有自身的缺陷，比如：有的时候特别注重对疾病特异性的诊断，比如AIDS的确诊，假如发现某定量指标对诊断AIDS有帮助，这时切不可用ROC分析，应该结合临床实际。注重研究特异性为100％的情况，不要过多地考虑敏感性。同时，部分疾病，其诊断对实验室指标依赖性不强，很多指标变化只是疾病作为的结果，也不宜使用ROC分析，因为实验室指标还面临来自影像学，病理学，病史，物理检查的挑战，在实验室指标不具备优势的情况下，不要盲目采用ROC分析。如从理论上讲，WBC计数可以用于诊断创伤，但是创伤的诊断绝对不依赖于WBC，因为其诊断主要靠病史。且不要闹笑话，采用ROC分析，分析WBC在创伤诊断中的作用。